近年來(lái)，能夠產(chǎn)生胞外多糖(EPS)的發(fā)酵劑的重要性顯著(zhù)增加，例如幾種乳酸菌(LAB)。在發(fā)酵乳制品中，EPS影響產(chǎn)品粘度和口感。EPS具有較高的水結合能力，對整個(gè)體系的粘度影響較大。以分離形式用于食品和制藥工業(yè)的EPS的例子有右旋糖酐或黃原膠。此外，重要的是要知道，由LAB產(chǎn)生的EPS要么附著(zhù)在細胞壁上(莢膜EPS)，要么釋放到周?chē)呐囵B基中(游離EPS)。

發(fā)酵劑的工業(yè)生產(chǎn)包括兩個(gè)主要過(guò)程步驟，在特定條件下發(fā)酵以及隨后從發(fā)酵液中分離細菌，這通常是用盤(pán)堆離心機完成的。在這里，EPS對發(fā)酵液粘度的影響使分離步驟變得困難。另一個(gè)復雜的因素是不同的發(fā)酵劑通常在同一條生產(chǎn)線(xiàn)上生產(chǎn)，這就是為什么分離條件應該根據各自的菌株進(jìn)行調整。EPS的特性和類(lèi)型(游離型、莢膜型或兩者都有)對發(fā)酵液的粘度有特定的影響，因此對細菌的沉積特性也有特定的影響。經(jīng)驗觀(guān)察表明，在細胞分離前應用高速剪切均質(zhì)可改善培養物的沉淀特性，但這種改善也取決于所產(chǎn)生的EPS類(lèi)型。

本研究的目的是系統地研究高速剪切均質(zhì)步驟對產(chǎn)EPS的乳酸菌菌株分離性能的影響。

1. 材料和方法  

1.1 材料  

研究了六種不同的嗜熱鏈球菌（ST）菌株，這些菌株在平均細胞鏈長(cháng)度和產(chǎn)生莢膜EPS的能力上存在差異(表1)。

表1 未剪切嗜熱鏈球菌莢膜EPS產(chǎn)量和平均細胞鏈長(cháng)度

1.3 顆粒沉降速度分析  

用光學(xué)分析離心機(LUMiSizer, LUM GmbH, Berlin, Germany)測量未剪切和剪切樣品的沉降速度分布。將稀釋樣品(與生理氯化鈉溶液的比例為1:2)填充到每個(gè)樣品管中，使用3600 rpm進(jìn)行測試。采用恒定位置法，在靠近樣品管底部的三個(gè)徑向位置(123、125和127毫米) 用SEPView程序計算沉降速度分布。

1.4 沉積物壓縮行為分析  

使用LUMiSizer測量樣品的沉積物壓縮。樣品管中加入未稀釋的樣品，LUMiSizer的速度以500 rpm為步階在1500 rpm和4000 rpm之間變化。

2. 結果與分析  

2.1 顆粒沉降速度

圖1 在19000rpm下剪切10 s（長(cháng)虛線(xiàn)）、30 s（短虛線(xiàn)）和120 s（虛線(xiàn)）后，未剪切（實(shí)線(xiàn)）細菌菌株ST-D（游離EPS，灰色）和ST-C（莢膜EPS，黑色）的沉降速度分布

由圖1可知，未剪切的ST-D沉積速度分布非常廣泛，從100 μm/s到近2000 μm/s。這可以歸因于細菌形成長(cháng)細胞鏈的能力(每鏈含2-19個(gè)球菌，見(jiàn)表1)，導致顆粒物體的體積和表觀(guān)顆粒尺寸增加。由于分布較廣，速度的頻率分布 (即在相同速度下沉積的顆粒數量的指標)很低。以19,000 rpm的UT速度剪切10秒，快速沉降顆粒的數量減少了，較慢沉降顆粒的數量增加了。結果，最大速度的頻率從0.6(未剪切)增加到1.0(剪切)。這反映了剪切作用對細胞鏈的部分破壞(圖2)。隨著(zhù)剪切時(shí)間的增加，細胞鏈被破壞的程度更大，導致沉積速度進(jìn)一步降低。在19,000 rpm剪切120 s后，平均鏈長(cháng)由13個(gè)單元減少到6個(gè)單元，在沉降速度為300 μm/s時(shí)，最大速度分布密度為2.4。

與ST-D相比，剪切后的ST-C沉積速度更高。在120 μm/s左右的沉降速度條件下，未剪切試樣的沉降速度主峰值為80 ~ 250 μm/s，最大沉降速度頻率為1.4?？焖俪两殿w粒(可能是細胞鏈)和緩慢沉降顆粒(可能是細胞碎片或細顆粒)也可見(jiàn)。使用UT在19,000 rpm下剪切10s后，沉降速度分布明顯提高。這種變化可以通過(guò)檢查ST-C產(chǎn)生的莢膜EPS層來(lái)解釋(見(jiàn)圖2未剪切和剪切培養的顯微鏡圖像)。將樣品與印度墨水混合，由于墨水顆粒無(wú)法滲透到莢膜多糖中，可見(jiàn)在細菌細胞周?chē)拭髁翆?。顯微鏡圖像表明，膠囊是在剪切過(guò)程中被去除的。由于EPS具有較高的水結合能力，我們假設細胞周?chē)那v膜EPS層起到了一種摩擦墊的作用，降低了細胞的沉積速度。所以，剪切去掉莢膜EPS層后，沉降速度升高是符合預期的結果。隨著(zhù)剪切時(shí)間的增加，沉降速度沒(méi)有進(jìn)一步提高，但細胞鏈斷裂明顯。剪切120 s后，在沉降速度約為140 μm/s時(shí)，最大沉降速度分布密度增大到2.3。這表明在細胞鏈被破壞之前，莢膜EPS已經(jīng)被剪切掉。對于產(chǎn)生游離EPS的菌株（ST-E），觀(guān)察到了類(lèi)似的結果，即剪切后沉降速度增加，可能是由于發(fā)酵液粘度發(fā)生了改變。在19,000 rpm的轉速下剪切120 s后，無(wú)細胞肉湯的表觀(guān)粘度下降了40%。因此，平均沉降速度由182 μm/s增加到206 μm/s，可以用Stokes定律解釋。

圖2  ST-D（游離EPS菌株）的顯微照片未剪切（左上），在24000rpm下剪切120秒（右上）。ST-C（莢膜EPS菌株）的顯微照片（印度墨水進(jìn)行染色）未經(jīng)剪切（左下），并在24000rpm下剪切120秒（右下）。  

2.2 能量輸入對顆粒沉降速度的影響  

圖3 剪切能輸入對細菌細胞沉降速度的影響。應變標識:ST-C，黑色方塊;ST-D，黑色圓圈;ST-E，灰色圓圈;ST-G，黑色三角形;ST-H，灰色三角形;ST-I，灰色方塊。

圖3說(shuō)明了六種ST菌株的沉降速度存在較大差異，剪切處理在不同程度上影響了沉降速度。沉淀最快的菌株是ST-D，它產(chǎn)生游離EPS并形成最長(cháng)的細胞鏈（見(jiàn)表1）。另一種產(chǎn)生游離EPS的菌株ST-E的沉降速度明顯低于ST-D，而ST-D的沉降速度又高于四種產(chǎn)生莢膜EPS的菌株。這是將莢膜EPS層解釋為減速摩擦墊的另一個(gè)原因。對于所有菌株，沉降速度與能量輸入呈對數依賴(lài)性或幾乎保持不變。隨著(zhù)能量輸入的增加，產(chǎn)生莢膜EPS的菌株表現為沉積速度增加的趨勢，該現象可以通過(guò)剪切破壞了菌株周?chē)糜跍p速的莢膜EPS層來(lái)解釋。

3. 結論  

本研究表明，剪切可以影響發(fā)酵培養基中細菌細胞的沉降速度。結果表明:(a)剪切莢膜EPS對沉積速度的影響最大;(b)對于只產(chǎn)生游離EPS的菌株，剪切降低了發(fā)酵液表觀(guān)粘度，從而提高了沉淀速度;(c)長(cháng)細胞鏈的破壞導致顆粒尺寸變小，從而導致沉降速度降低。平均沉降速度的比較揭示了這三種影響的組合。由于粘度的變化導致較高的沉降速度，使沉積物形成速度加快，但對沉積物壓縮沒(méi)有影響。細胞鏈的破壞降低了沉積速度，但由于顆粒尺寸的減小，導致沉積物更加致密。由于剪切作用發(fā)酵劑表面的莢膜EPS減少，從而降低了顆粒之間的相互依賴(lài)性，因此，導致沉積物的強烈壓實(shí)，這可能有助于發(fā)酵劑生產(chǎn)過(guò)程中細胞的分離。